利用轉(zhuǎn)移PCR技術(shù)構(gòu)建玉米SnRK2基因家族表達(dá)載體
摘要：在構(gòu)建玉米蔗糖非酵解型蛋白激酶2(SnRK2)基因家族表達(dá)載體的過程中,因?yàn)楸磉_(dá)載體可供選擇的多克隆位點(diǎn)較少,且有些還與目的基因同源,所以采用轉(zhuǎn)移PCR(T-PCR)擴(kuò)增技術(shù)替代通常的酶切連接方法。為避免錯(cuò)誤連接或未連接的第一輪T-PCR中間產(chǎn)物對退火溫度不同的第二輪擴(kuò)增循環(huán)產(chǎn)生干擾,本研究對T-PCR接頭引物3′-端和5′-端的兩段序列及其退火溫度、引物、供體質(zhì)粒和目標(biāo)質(zhì)粒模板的濃度,特別是溫度循環(huán)程序進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選,并用擴(kuò)增構(gòu)建的重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,進(jìn)行菌液PCR和測序驗(yàn)證。結(jié)果表明,在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差不大的情況下,T-PCR第一輪擴(kuò)增的退火溫度以低于或接近其中較低的理論退火溫度為宜。但在兩條引物3′-端序列理論退火溫度相差較大的情況下,則應(yīng)高于其中較低的理論退火溫度。T-PCR第二輪擴(kuò)增的退火溫度,適當(dāng)?shù)陀趦蓷l引物理論退火溫度的平均值。按優(yōu)化的溫度循環(huán)程序,從供體質(zhì)粒pMD19-T擴(kuò)增ZmSnRK2基因家族8個(gè)成員的編碼序列,并整合到目標(biāo)載體pHBT95啟動(dòng)子下游特異位點(diǎn),重組率達(dá)60%以上。綜上表明,T-PCR對沒有適用多克隆位點(diǎn)的載體構(gòu)建的實(shí)用性較強(qiáng)。本研究通過優(yōu)化的溫度循環(huán)程序?yàn)楸磉_(dá)或誘變載體構(gòu)建提供了一定的理論參考。
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