摘要：目的構(gòu)建用于呼吸道合胞病毒(respiratorysyncytialvirus,RSV)體外拯救的RSV基因組全長(zhǎng)cDNA克隆,并進(jìn)行鑒定。方法根據(jù)RSVLong株基因組序列設(shè)計(jì)并合成引物,利用RT-PCR技術(shù)分6段擴(kuò)增RSVLZ01/09基因組序列并構(gòu)建克隆載體;測(cè)序后,利用重疊PCR與酶切連接技術(shù),根據(jù)基因組序列選擇特異性酶切位點(diǎn),引入KpnI、XmaI和SalI酶切位點(diǎn),構(gòu)建成4個(gè)亞克隆載體;將亞克隆載體的插入片段連接至經(jīng)過(guò)改造且包含T7啟動(dòng)子、錘頭狀核酶、多克隆位點(diǎn)、丁肝核酶、T7終止子的pRSV1載體中,構(gòu)建RSV基因組全長(zhǎng)cDNA克隆;對(duì)克隆全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行測(cè)定,與親本RSVLZ01/09基因組進(jìn)行同源性比對(duì)分析,并與RSV實(shí)驗(yàn)參比株進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析。結(jié)果測(cè)序結(jié)果顯示,RSVLZ01/09的基因組全長(zhǎng)為15204bp,與GenBank公布的RSV基因組序列長(zhǎng)度相當(dāng),將完整的序列提交GenBank,登錄號(hào)為KY782635;酶切及測(cè)序結(jié)果顯示,用于RSV全長(zhǎng)cDNA克隆構(gòu)建的基本載體pBSKS-MCS(簡(jiǎn)稱pRSV1)與預(yù)期相符,RSV全長(zhǎng)基因組cDNA克隆質(zhì)粒(簡(jiǎn)稱轉(zhuǎn)錄載體pRSV1-4F)酶切片段大小與預(yù)期一致;同源性比對(duì)結(jié)果顯示,全長(zhǎng)cDNA序列與親本RSVLZ01/09基因組序列同源性高達(dá)99.83%;系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示,其與RSV-A亞型序列同屬于一個(gè)分支。結(jié)論測(cè)序及酶切分析結(jié)果表明已成功構(gòu)建RSVLZ01/09基因組全長(zhǎng)cDNA克隆,為建立拯救RSV重組病毒的反向遺傳學(xué)系統(tǒng)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。