摘要：旨在利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)制備CD13基因敲除的IPEC-J2(豬空腸上皮細(xì)胞系)細(xì)胞,揭示細(xì)胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13,CD13)在腸道病原微生物感染腸道細(xì)胞中所起的作用。本研究在豬CD13基因第2外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)2個(gè)向?qū)NA(guide RNA,gRNA),命名為g3、g5,然后分別將g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP載體骨架上,電轉(zhuǎn)染IPEC-J2細(xì)胞,48 h后通過流式細(xì)胞術(shù)分選具有雙熒光標(biāo)記的細(xì)胞,培養(yǎng)并獲得單克隆細(xì)胞,PCR擴(kuò)增、測序,從而獲得CD13基因純合敲除的陽性細(xì)胞系。對獲得的20個(gè)細(xì)胞單克隆進(jìn)行PCR,并挑取部分克隆PCR產(chǎn)物測序,發(fā)現(xiàn)共有7個(gè)克隆發(fā)生了基因片段缺失,其中1個(gè)克隆為單等位基因片段缺失,3個(gè)克隆為雙等位基因雜合片段缺失,3個(gè)克隆為雙等位基因純合片段敲除。本研究檢測雙等位基因純合片段敲除細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平,其結(jié)果顯示,在該純合敲除細(xì)胞中CD13蛋白幾乎不表達(dá),表明成功構(gòu)建了CD13敲除的IPEC-J2細(xì)胞系。本研究獲得的CD13基因敲除細(xì)胞系為探究CD13在豬腸道病原微生物感染腸道細(xì)胞中所起的作用奠定了基礎(chǔ)。