摘要：目的結(jié)合重組酶介導(dǎo)的核酸等溫?cái)U(kuò)增(recombinase aided amplification, RAA)和熒光探針方法建立日本血吸蟲特異性基因片段的快速檢測方法。方法以日本血吸蟲G28 (Sj G28)基因片段作為靶序列,應(yīng)用DNAMAN 7.0軟件設(shè)計(jì)合成引物及熒光探針,建立熒光RAA反應(yīng)體系。擴(kuò)增不同拷貝數(shù)的Sj G28重組質(zhì)粒,評價(jià)熒光RAA檢測的敏感性;分別以日本血吸蟲、曼氏血吸蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、十二指腸鉤口線蟲、似蚓蛔線蟲、華支睪吸蟲基因組為模板進(jìn)行熒光RAA檢測,以評價(jià)該方法的特異性。采用熒光RAA分別檢測500、 200和50條日本血吸蟲尾蚴感染的兔糞中蟲卵DNA。分別在50只陰性釘螺中混入1、 2、 3、 4、 5、 10只陽性釘螺,并提取DNA進(jìn)行熒光RAA檢測。結(jié)果以不同拷貝數(shù)的Sj G28重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光RAA擴(kuò)增,在5 min時(shí)即可觀察到明顯的熒光信號,隨著拷貝數(shù)的不斷降低,檢測到熒光信號的時(shí)間也隨之延長,不同拷貝數(shù)的擴(kuò)增均在10 min內(nèi)完成,最低可檢出的質(zhì)粒濃度為10拷貝/μl。以曼氏血吸蟲、細(xì)粒棘球絳蟲、十二指腸鉤口線蟲、似蚓蛔線蟲及華支睪吸蟲基因組DNA為模板的熒光RAA擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。不同數(shù)量尾蚴感染的兔糞中提取的DNA樣品經(jīng)熒光RAA檢測,均能得到有效的擴(kuò)增,檢測可在15 min內(nèi)完成。含不同數(shù)量陽性釘螺的50只陰性釘螺提取的日本血吸蟲DNA經(jīng)熒光RAA檢測,均能得到有效的擴(kuò)增,檢測可在10 min內(nèi)完成。結(jié)論本研究建立的可檢測日本血吸蟲核酸片段的熒光RAA方法,反應(yīng)快捷,敏感性和特異性均較高。